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可溶性凋亡基因sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒
更新時間：2013-06-19
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sCD95（APO1/Fas） ELISA 試劑盒
用途：
人sCD95 ELISA 試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、緩沖液或細胞培養液中的可溶性
CD95（APO-1, Fas）。本實驗可以檢測天然的和重組的sCD95。本試劑盒于研究，而非
用于診斷。
試驗原理：
sCD95 試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。抗sCD95 特異單克隆抗體包被
微孔板，已知sCD95 濃度的標準樣本、對照樣本和未知樣本加入微孔進行檢測。
先將sCD95 抗原和生物素標記的抗sCD95 特異單克隆抗體同時孵育。洗滌后，加入親和
素過氧化物酶。再經過孵育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入酶復合物的作用底物，產生
顏色反應。顏色的深淺和樣本中sCD95 的濃度呈比例關系。
提供的試劑和配制方法：
| 試劑（2~8℃保存） | 數量 | 色標 | 配制 |
| 96 微孔板 | 1 | | 即用型 |
| 塑料蓋板 | 2 | | |
| 標準品：3000pg/ml | 2 支凍干粉 | 黃色 | 按標簽要求以標準稀釋液稀釋 |
| 對照 | 2 支 | 銀色 | 按標簽要求以標準稀釋液稀釋 |
| 標準稀釋緩沖液 | 1 支（25ml） | 黑色 | 10X, 用蒸餾水稀釋 |
| 生物素標記抗sCD95 | 1 支（0.4ml） | 紅色 | 用生物素標記抗體稀釋液稀釋 |
| 生物素標記抗體稀釋液 | 1 支（13ml） | 紅色 | 即用型 |
| 親和素HRP | 2 支（5ul） | | 0.5mlHRP 稀釋液預稀釋 |
| HRP 稀釋液 | 1 支（23ml） | 紅色 | 即用型 |
| 洗滌液 | 1 支（10ml） | 白色 | 200X, 用蒸餾水稀釋 |
| TMB | 1 支（24ml） | | 即用型 |
| 硫酸終止液 | 1 支（11ml） | 黑色 | 即用型 |
試驗需要但未提供的用品：
?? 蒸餾水
?? 微量加樣器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
?? 旋渦振蕩器和磁力攪拌器
安全性：
?? 僅用于科研
?? 本試驗所用的人血成分均經檢測，不含有HbsAg 和抗HIV 陽性物質。盡管如此，無法
確保沒有傳播肝炎或艾滋病等的可能。因此處理這些血清、血漿樣本時，應該遵守
有關的安全操作規程，例如CDC/NIH 健康手冊：“微生物學和生物醫學試驗中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 與皮膚接觸。如有接觸，可用水*沖洗。
→ 不可在使用試劑盒的地方吃飯、飲水、吸煙或化妝。
→ 不可用口吸取樣本。
操作要點/試驗室質量控制：
1、 使用前應根據標簽上指示冷藏。使用時所有試劑應平衡至室溫。凍干標準品使用后
應丟棄。
2、 取出所需的孔條后，立即密封包裝，以防變質。
3、 不用時所有試劑要加蓋封好。
4、 不同批號的試劑不可混用。
5、 過期的試劑不可再用。
6、 使用干凈的吸頭來吸取各種試劑、標準品、對照或樣本，以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
7、 用干凈的塑料容器配備洗滌液。
8、 使用前用振蕩器*混勻各種試劑。
9、 微孔內殘留液須充分吸干或在吸水紙上拍干，吸水紙不可插入孔內吸水。
10、 TMB溶液是光敏的，避免長時光照。避免與金屬接觸產生顏色反應。
警告：TMB 有毒，避免手直接接觸，并妥當處理。
11、 如配制后幾分鐘產生深蘭色，表明TMB 溶液被污染，必須棄去。在檢測完成
后一小時內必須讀結果。
12、 吸取樣本時，按順序逐孔加樣，以確保孵育時間相同。
13、 孵育時間見操作規程。
14、 在洗滌微孔板之后15 分鐘內加入TMB 溶液。
樣品收集，處理和保存
1、 細胞培養上清液——1000xg 離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
2、 血清——操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液
后，1000xg 離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
3、 血漿——EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測。1000Xg 離心30 分鐘去除顆粒。
4、 保存——如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免
反復冷凍。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測前
先離心或過濾。
注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑準備：
1、標準稀釋緩沖液
蒸餾水10 倍稀釋。
2、標準品
按標簽要求以標準稀釋液配制，其濃度為3000pg/ml sCD95，可儲存。稀釋前輕輕
振蕩此標準品5 分鐘。每次實驗前將此標準品進行系列稀釋，不能保存。
3、對照
按標簽要求以標準稀釋液配制。加樣前輕輕振蕩對照5 分鐘。稀釋后不能儲存。
4、生物素標記抗sCD95 的稀釋
生物素標記抗sCD95 用生物素標記抗體稀釋液根據使用微孔數在干凈玻璃管中
稀釋。試驗時準備。參見下表：
| 使用微孔數 | 生物素標記的抗體（ul） | 生物素標記抗體稀釋液（ul） |
| 16 | 40 | 1060 |
| 24 | 60 | 1590 |
| 32 | 80 | 2120 |
| 48 | 120 | 3180 |
| 96 | 240 | 6360 |
5、 親和素HRP 的稀釋
在含5ul 親和素HRP 的瓶內加入0.5ml HRP 稀釋液。本液為一次性使用。
根據使用微孔數在干凈玻璃管中進一步稀釋。參見下表：
| 使用微孔數 | 親和素HRP（ul） | HRP 稀釋液（ml） |
| 16 | 30 | 2 |
| 24 | 45 | 3 |
| 32 | 60 | 4 |
| 48 | 75 | 5 |
| 96 | 150 | 10 |
6、 洗滌緩沖液的稀釋
蒸餾水200 倍稀釋。
檢測方法：
1、 試劑用前充分混勻，避免產生泡沫。
2、 確定需要的微孔數，所有樣本、標準品、空白和對照樣本均要做雙份。
3、 加100ul 配好的標準稀釋液至標準孔B1,B2,C1,C2,D1,D2,E1,E2,F1,F2。（配制見前
述）吸取200ul 標準品加入A1,A2。（見下表）從A1,A2 中吸取100ul 至B1,B2 孔內；
反復吸排，使之混合。重復此步驟，從B1,B2 至C1,C2，然后從C1,C2 至D1,D2 等等。
sCD95 標準稀釋液濃度由3000 至93.75pg/ml。從zui后的F1,F2 孔內吸取100ul 棄掉。
4、 加100ul 配好的標準稀釋液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 樣本至樣本孔和100ul 對照品至對照孔H1,H2。
6、 配制生物素標記的抗sCD95。（配制見前述）
7、 加50ul 生物素標記的抗sCD95 稀釋液于所有孔內。
8、 蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育1 小時。
9、 洗滌微孔板：① 吸去孔內液
② 加0.3ml 洗滌液于各孔
③ 再吸去各孔內液
④ 重復②和③二次
10、 僅在用前配制HRP 液。（配制見前述）
11、 加100ulHRP 液于各孔，含空白孔。加蓋。
12、 室溫下孵育0.5 小時。
13、 洗滌微孔板。（見步驟9）
14、 加100ulTMB 底物液至各孔。室溫下避光孵育20 至30 分鐘。
15、 通常根據ELISA 閱讀器確定孵育時間：許多ELISA 閱讀器僅讀數至2.0 O.D 值。
監察O.D 值，應在陽性結果衰褪前終止反應。（不超過20 分鐘）
16、 酶底物反應用100ul 硫酸加入各孔內終止。終止反應后1 小時內（這段時間在2
至8℃避光保存）或加入硫酸后立即讀取結果。
17、 用分光光度儀讀數，450nm 作為初始波長，620nm（可以用610 至650nm）作為
參考波長。
建議微孔板編碼：
| | 標準濃度（pg/ml） | 樣本孔 | ||||||||||
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 3000 | 3000 | | | | | | | | | | |
| B | 1500 | 1500 | | | | | | | | | | |
| C | 750 | 750 | | | | | | | | | | |
| D | 375 | 375 | | | | | | | | | | |
| E | 187.5 | 187.5 | | | | | | | | | | |
| F | 93.75 | 93.75 | | | | | | | | | | |
| G | 空白 | 空白 | | | | | | | | | | |
| H | 對照 | 對照 | | | | | | | | | | |
結果分析：
制作一條標準曲線，平均光吸收值作Y 軸，對應的sCD95 濃度作X 軸。各樣本中的sCD95
含量可根據樣本O.D 值通過標準曲線來確定。
本試驗的局限性：
超過標準曲線范圍（3000pg/ml）時，不可推測結果；樣本必須稀釋后再檢測。
本試驗的檢測特性：
1、 敏感性：zui小檢測濃度低于47pg/ml。
2、 準確性：
| 批內 | 批間 | ||||||||
| 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV% | 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV % |
| A | 14 | 1719 | 106 | 6.1 | A | 8 | 1752 | 145 | 8.2 |
| B | 16 | 703 | 39 | 5.5 | B | 8 | 856 | 68 | 7.9 |
檢測程序小結： 總時間 = 1 小時45 分鐘
加100ul 樣本或配好的標準品或對照
加50ul 配好的生物素標記的抗體于各孔內
室溫孵育1 小時
洗3 次
加100ul 親和素-HRP 標記物
室溫孵育0.5 小時
洗3 次
加100ul TMB，避光，顯色20 至30 分鐘
加100ul 硫酸，終止反應
在450nm 處讀取吸光度
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注意: 請以原文說明書為準
