鏈脲佐菌素 (Streptozotocin，STZ)-糖尿病動(dòng)物模型造模

1. STZ誘發(fā)糖尿病動(dòng)物模型的原理

STZ對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用，能誘發(fā)許多動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造動(dòng)物模型。I型糖尿病與II型糖尿病動(dòng)物模型的制備與STZ注射的劑量有關(guān)系：大劑量注射時(shí)，由于直接引起胰島β細(xì)胞的廣泛破壞，可造成I型糖尿病模型；而注射較少量STZ時(shí)，由于只是破壞一部分胰島β細(xì)胞的功能，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，同時(shí)給予高熱量飼料喂養(yǎng)，兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類II型糖尿病的動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者報(bào)道選用雄性大鼠制造模型的成模率明顯高于雌性大鼠。

2. 糖尿病模型動(dòng)物的選擇（體重，周齡，性別）

2.1 I型糖尿病（Type I diabetes）動(dòng)物選擇

一般按照體重選擇即可，推薦大鼠170-200g，小鼠17-22g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1~2周后空腹注射STZ，成模率相對(duì)理想?！窘?jīng)驗(yàn)顯示動(dòng)物體重過(guò)高，比如當(dāng)大鼠超過(guò)300g或小鼠超過(guò)35g，對(duì)STZ的耐藥性加強(qiáng)，成模率隨之降低。不建議使用超重的動(dòng)物建模?！?/span>

建議全部選擇雄性動(dòng)物，除非是實(shí)驗(yàn)方案有特定要求。有研究顯示，雌性動(dòng)物成模率差，而且可能會(huì)比雄性出現(xiàn)更高死亡率，尤其是I型。

2.2  II型糖尿?。?/span>Type II diabetes）動(dòng)物選擇

對(duì)于大鼠（比如SD/Wistar），選取4-5周齡，體重在90-100g，高脂（高糖）飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)240-280g。 對(duì)于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），選取4-5周齡，體重在16-20g，高脂（高糖）飼料喂養(yǎng)4-6周體重約達(dá)30-35g。 對(duì)于新購(gòu)入動(dòng)物或更換飼養(yǎng)環(huán)境需要先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后再選擇適合周齡/體重動(dòng)物轉(zhuǎn)用高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)。從模型建立成功率來(lái)看，大鼠推薦用SD，小鼠推薦C57。 建議全部選擇雄性動(dòng)物，除非是實(shí)驗(yàn)方案有特定要求。

3. STZ給藥前動(dòng)物的喂養(yǎng)

3.1Ⅰ型糖尿病模型：因成模比較快，通常動(dòng)物在普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1-2周后即可開始造模

3.2Ⅱ型糖尿病模型：高脂高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)加小劑量STZ。造模前喂以高脂（高糖）飼料4-6周，誘發(fā)出胰島素抵抗，再注射STZ。

4. 高脂（高糖）飼料

高脂（高糖）飼料基本要求：含10%蔗糖，10%豬油，5%膽固醇。由基礎(chǔ)維持飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比搭配制作高脂高糖飼料：其比例為豬油18 % ,蔗糖20 % ,蛋黃3 % ,基礎(chǔ)飼料59 %。飼料的成分比不是的，可為了迎合口感，根據(jù)動(dòng)物愛好，增加一些成分如豬油或全脂奶粉。

5. 預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性

非常重要。實(shí)驗(yàn)時(shí)STZ的給藥量應(yīng)參照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定，盡量不要盲目按照文獻(xiàn)上或他人的給藥量來(lái)直接使用。因?yàn)閯?dòng)物均重和空腹（低糖狀態(tài)）抗藥力、禁食時(shí)長(zhǎng)、注射手法、以及之前飼養(yǎng)過(guò)程、測(cè)糖選時(shí)等都不相同，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定符合自己實(shí)驗(yàn)情況的給藥劑量，才是zui科學(xué)的。

6. 常用給藥劑量（STZ）

動(dòng)物體重不同，STZ給藥量也不同。一般情況STZ劑量（mg/kg）高低和體重大小呈反比。

1200g均重大鼠為例，I型糖尿病，可用70~65mg/kg一次性給藥（或分次注射如35mg/kg，2次）。

以250g均重大鼠為例，II型糖尿病，先喂養(yǎng)4-8周的高脂（高糖）飼料，可用35~50mg/kg一次給藥。

以20g均重小鼠為例，I型糖尿病，可用150-220mg/kg一次性給藥（或分2次，100mg/kg）。

以30g均重小鼠為例，II型糖尿病，先喂養(yǎng)4-8周的高脂（高糖）飼料，可用70~120mg/kg一次給藥。

給藥劑量是影響成模率的zui大因素，以上僅做參考。具體劑量請(qǐng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)確定。

7. 一次給藥和多次給藥的選擇

假如需要給藥150mg/kg，可每次給藥50mg/kg，連續(xù)給3次。需注意的是與一次給藥（150mg/kg）相比，多次給藥造成動(dòng)物死亡率可能得到緩解，但STZ對(duì)胰島細(xì)胞的破壞力不如一次給藥明顯。換句話說(shuō)，多次給藥可能減少死亡，但是一次注射效果明顯。建議根據(jù)動(dòng)物品種和耐受能力來(lái)決定給藥次數(shù)。目前大部分用戶采用一次給藥。

8. 多次給藥方式的選擇

大劑量STZ注射后，藥力發(fā)揮主要集中在注射后的3-72h。如果采用多次給藥，建議在2-72h內(nèi)延續(xù)第二次給藥，目前大部分用戶選擇24h為給藥周期居多。小劑量給藥STZ，當(dāng)使用劑量偏低（低于理想值），動(dòng)物可能在第二周出現(xiàn)血糖緩慢提升跡象，但隨著血糖峰值放緩且后延，有出現(xiàn)血糖先高后低、zui終回落的可能。 多次給藥的總次數(shù)1-7次都有用過(guò)。總體上，1次和3次用的偏多。

9. 禁食和血糖的關(guān)系

禁食12h以上（一般過(guò)夜禁食，不禁水）。禁食的時(shí)間越長(zhǎng)，STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的破壞力越明顯，即藥效越高。所以相對(duì)禁食時(shí)間延長(zhǎng)，可以降低STZ的用量。

10. STZ注射液的配置

10.1  STZ溶液的選擇

配制STZ選擇的溶液推薦用檸檬酸緩沖液，此緩沖液的pH范圍能很好的控制在4.2~4.5，STZ在此pH范圍內(nèi)藥效*。當(dāng)然，也可使用其他溶液比如醋酸等，但pH值不好控制。

10.2  檸檬酸緩沖液的配制

稱取2.1g 檸檬酸（Mw: 210.14）加入雙蒸水100mL充分溶解中配成A液；

稱取2.94g 檸檬酸鈉（Mw: 294.10）加入雙蒸水100mL充分溶解中配成B液；

將A、B液按比例混合（1：1.32，也有按1:1），pH計(jì)測(cè)定并調(diào)節(jié)pH=4.2-4.5，用0.22µm或0.45µm濾膜過(guò)濾除雜，即是配置STZ的檸檬酸緩沖液。根據(jù)實(shí)際需要等比縮小或放大配制，盡量現(xiàn)配現(xiàn)用以防止氧化引起pH漂移。

【注意事項(xiàng)】：

a) 如果緩沖液配好后pH值不在范圍內(nèi)如何調(diào)節(jié)？—偏酸用檸檬酸鈉（或雙蒸水）調(diào)整，偏堿用檸檬酸調(diào)整。

b）緩沖液是否需要過(guò)濾？—必須過(guò)濾，我司（懋康生物）贈(zèng)送的檸檬酸/檸檬酸鈉屬于AR級(jí)化學(xué)試劑，內(nèi)含雜質(zhì)和其他離子，會(huì)影響動(dòng)物對(duì)STZ的吸收。特別是靜脈注射，嚴(yán)格要求過(guò)濾。

c）緩沖液是否需要滅菌？—滅菌是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，這個(gè)沒有實(shí)際的數(shù)據(jù)。如果條件允許，靜脈注射需要滅菌（120℃，20min）；腹腔注射可做可不做。

d）緩沖液是否能儲(chǔ)存再用？— 可以，但使用前需再次測(cè)pH值，確保合乎范圍。建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

11. STZ注射操作事宜

過(guò)夜禁食后稱重，按動(dòng)物數(shù)目和注射劑量來(lái)計(jì)算，稱取所需的STZ（凍干粉），放到一干燥的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，用鋁箔或錫箔紙包好。將檸檬酸緩沖液和裝STZ的瓶子提前置于冰浴中，一起帶到動(dòng)物房。 按照1%（w/v）濃度加入適量的檸檬酸緩沖液溶解STZ，充分溶解。按照動(dòng)物空腹體重注射相應(yīng)體積的STZ， 需在30min內(nèi)注射完畢。對(duì)于注射技術(shù)不是很熟練，建議兩組交替注射，分組溶解STZ，比如10只鼠/組或15只鼠/組。

12. 注射時(shí)，推進(jìn)速度與血糖關(guān)系

一般來(lái)說(shuō)，推注速度快，更容易形成高血糖；推注速度慢，相對(duì)危險(xiǎn)性較低。常規(guī)操作中多要求快速注射。當(dāng)然，STZ劑量是決定血糖高低的主要因素。

13. 腹腔注射和靜脈注射的區(qū)別

靜脈注射（尾靜脈注射）藥物利用率高，與腹腔注射相比，可以節(jié)省藥量，但操作起來(lái)不如腹腔注射方便。

14. 未達(dá)標(biāo)模型如何補(bǔ)救

模型不*，穩(wěn)定后補(bǔ)注STZ（以10mg-20mg/kg體重劑量腹腔注射，根據(jù)實(shí)際情況選擇合適劑量）也可以成模?；蛘叽腔謴?fù)正常后再按常規(guī)劑量注射。但想要達(dá)到理想的效果，往往是恢復(fù)到正常狀態(tài)下重新造模。

15. 如何解決死鼠問(wèn)題

鼠的個(gè)體差別和空腹（低血糖）抵抗力的差異而致死亡率的不同，開始死亡率高可能主要是血糖突然升高，鼠不適應(yīng)，或發(fā)生了糖尿病酮癥酸中毒(diabetic ketoacidosis, DKA)。要解決死鼠問(wèn)題，可通過(guò)以下方式來(lái)降低或避免死亡：

a）一定要保證足夠的飲水量（飲水量不足容易導(dǎo)致死鼠）

b）高血糖和低血糖都會(huì)造成死鼠，避免死鼠可以通過(guò)注射胰島素或暫時(shí)補(bǔ)糖，兩種途徑： 1）常見為血糖過(guò)高。使用補(bǔ)胰島素法，補(bǔ)一些中效胰島素，例如中性低精蛋白鋅人胰島素（諾和靈N），每次2-3個(gè)單位，過(guò)了3-5天，大鼠一般死亡率就低了；2）補(bǔ)糖法，禁食后的鼠，注射的時(shí)候已經(jīng)處于低血糖狀態(tài)，造模4小時(shí)后腹腔注射20%葡萄糖，可避免因注射時(shí)血糖過(guò)低引起的死鼠。

c）防止動(dòng)物自相殘殺。食物缺乏和供水不足的情況下，會(huì)互相撕殺、啃食同類,所以食物和飲水要供應(yīng)充足,好的辦法是是兩路供應(yīng)。

d）防止感染。糖尿病大鼠尿量多，墊料潮濕，需要勤換墊料，所以糖尿病鼠較其他鼠更易出現(xiàn)感染，特別是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血測(cè)血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血測(cè)血糖后可用四環(huán)素（或金霉素眼藥膏）局部涂抹處理傷口預(yù)防感染。

16. STZ保存和稱量注意事項(xiàng)

保存：STZ置于-20℃凍存，避光干燥，可穩(wěn)定至少保存2年。【有數(shù)據(jù)測(cè)試取一瓶按要求保存12年的STZ樣品，HPLC檢測(cè)顯示期內(nèi)的α-anomer由原來(lái)的94.9%減低到94.7%，穩(wěn)定性還是很理想的。】

稱量：由于STZ比較容易受潮，在反復(fù)稱量郭晨中很容易接觸到空氣中潮氣，其受潮30min后會(huì)失效，這和注射時(shí)要求快速注射也是一個(gè)道理，STZ水溶液也不是很穩(wěn)定。為此，盡量避免反復(fù)稱量，*次使用本品可根據(jù)估算的單次用量分裝（操作環(huán)境、盛裝容器、分裝工具都必須保證干燥）。分裝后用封口膜密封瓶口。用鋁箔紙或錫箔紙避光包好，放入干燥罐內(nèi)（含干燥劑），-20℃凍存。

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經(jīng)驗(yàn)交流：糖尿病動(dòng)物模型造模故事【僅是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，供經(jīng)驗(yàn)交流用，不是教科書哦】

實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)A:

不管是四氧嘧啶還是STZ 造模，造模后的飼養(yǎng)是關(guān)鍵，我們一天要給大鼠換水四至五次，飼料喂三至四次（每次喂足夠飼料），換水是早上7：00一次，白天隨時(shí)補(bǔ)足，晚上10：00再給足水和飼料。有些動(dòng)物的狀態(tài)不是很好，可能搶不到足夠的飼料和飲水，所以在飼養(yǎng)籠里也要注意加入適當(dāng)?shù)娘暳?。為了給足飲水，我們?cè)诖笫箫曫B(yǎng)籠上再加一個(gè)水瓶架，就是比普通的飼養(yǎng)籠要多一個(gè)飲水口和雙倍水量。

另外，光照也是影響糖尿病大鼠死亡的原因之一，光照不能太強(qiáng)烈，請(qǐng)不要有太陽(yáng)光出現(xiàn)，如有窗戶的房間要把窗戶用紙糊起來(lái)。

我的經(jīng)驗(yàn)是飼料要保持干燥，潮濕后長(zhǎng)霉菌造模鼠易腹瀉；正常鼠可飲自來(lái)水，而造模鼠要給燒開過(guò)的水，這樣不容易感染；此外墊料必須一天換一次，室內(nèi)要勤消毒。剛開始我都沒注意這些方面，結(jié)果一個(gè)月死了１３只，后來(lái)嚴(yán)格注意，近一個(gè)月一只未死。

死亡原因可能有以下幾點(diǎn):

①大鼠太小,也就是大鼠體重不夠，容易引起死亡。②不知道你用的是什么大鼠，SD？Wistar？如果是后者，死亡就更多了（只是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，還沒有得到具體實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，僅作參考）。③還有就是在造模后一定要加足水和飼料，而且要注意大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境，要保持盡量干凈，光照不能太強(qiáng)（避免有太陽(yáng)光）！我認(rèn)為在造模后24小時(shí)內(nèi)死亡的主要原因是胰島細(xì)胞破壞后胰島素大量釋放導(dǎo)致的低血糖而亡，你不妨拿少量大鼠作個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)測(cè)血糖看看，解決的辦法可在STZ注射后給予0.5％葡萄糖飲水。充足的飲水和保持敷料干燥是成模后減少死亡的方法。

成模標(biāo)準(zhǔn)：

1）首先關(guān)鍵是糖尿病模型成模與否的鑒定，不少報(bào)道稱造模后血糖有波動(dòng)，建議持續(xù)觀察。建議檢測(cè)點(diǎn)：10d、2w、3-4w、5w，以明確血糖變化，確定模型建立時(shí)間。——推斷相關(guān)疾病成模時(shí)間

STZ造模后，明顯血糖水平波動(dòng)呈現(xiàn)3個(gè)時(shí)相，一時(shí)性高血糖（1-2h）、短暫低血糖（6-10h）、持續(xù)高血糖（>72h）。必須適當(dāng)補(bǔ)給胰島素和葡萄糖。

2）我也造了一批模型，雄性SD大鼠，體重控制180－200g，STZ用量60mg/kg，我的PH值沒有像別的同學(xué)那樣用酸堿儀測(cè)，只是用PH試紙而已。但是我覺得一周或十天成模的方法不可信，加預(yù)實(shí)驗(yàn)我做了80只SD大鼠，腹腔注射后十天成模率90％，2周左右成模了的大鼠大約有一半恢復(fù)，3－4周左右血糖又開始升高，大概5周左右，血糖開始穩(wěn)定且比較穩(wěn)定。血糖升高以后每天更換木糠，因?yàn)槟Ｐ徒M尿量多，我經(jīng)常是一天換兩次，我的模型已經(jīng)做了8周，而且每天灌喂，目前情況還好，暫時(shí)還沒有死亡，而且我一直沒有使用胰島素。

實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)B:

模型穩(wěn)定性及持續(xù)時(shí)間:

1、WISTAR大鼠（雌雄各半），200-300克體重，STZ用量，60mg/Kg。溶液：檸檬酸緩沖液（0.1mol/l，PH4.5）。腹腔注射。

2、緩沖液新鮮配制，溶解STZ后立即注射，別耽誤太久了，腹腔注射注意勿入臟器。

3、12小時(shí)后，出現(xiàn)多飲癥狀，部分的血糖開始升高，7天后血糖大于16.65約80%。十天后90%

4、注射STZ后第二天開始，每天換墊料，注意充足的水及飼料。

5、雄鼠血糖持續(xù)偏高，目前已經(jīng)4個(gè)月了，很穩(wěn)定。雌鼠血糖不穩(wěn)定，在一個(gè)月左右時(shí)間，血糖明顯恢復(fù)，大部分血糖下降到10左右，持續(xù)約一月，又開始上升，達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)，此后比較穩(wěn)定，

失敗原因分析

10天還沒有成模型，可能要考慮一下：

1、腹腔注射的技術(shù)，是否注射到腸子里了

2、STZ的配制是否合適，用PH4.6左右的0.1M的檸檬酸緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，如果操作慢，請(qǐng)放在冰浴里。

3、注射STZ之前是否禁食了，應(yīng)該禁食12h左右。建議，再觀察3天，還是不成模型的話，重新注射一次。